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药物性肝损伤的生物标记研究进展

2014-07-17

药物性肝损伤（DILI）是目前威胁人类健康和药物研发的重大问题，并且已经成为欧美等发达国家急性肝衰竭和肝移植的主要原因[1-2]。DILI发病机制复杂，临床表现与多种肝病相似【3】，所以DILI的预防和鉴别诊断成为目前临床医生面对的最大难题，因此，寻找新型兼具敏感性和特异性的生物标记成为当前DILI研究领域迫在眉睫的艰巨任务。

理想的生物学标记应该具有以下特点【4】：

①准确反应损伤的不同阶段；②无创性（血液、尿液）； ③不同的检测机构具有统一的标准；④同时适用于体内、体外和动物试验；⑤患病人群和健康人群之间差别明显；⑥易于准确识别和定量分析；⑦具有良好的敏感性和特异性。

一、传统的DILI生物学标记

目前临床生化学检查仍然是DILI诊断时最常用的指标，转氨酶活性改变最为常见,通常情况下，ALT是反映肝损伤的标记，其敏感性较AST更强【5】。 FDA在去年发表的有关药物研发的DILI指南【6】中指出，DILI患者中，ALT高于3倍正常上限，同时伴胆红素水平超过两倍正常上限的Hy‘s 法则患者，易出现严重的肝损伤，且预后不良。尽管ALT活性增高反映肝损伤的敏感性较强，但特异性并不强，此外，ALT虽然可以反映肝损伤，但对病因学因果关系的评估上并无任何价值，因为除药物之外，其他病因（酒精、病毒等）引起肝细胞损伤，也会出现ALT活性升高。胆红素尽管特异性较强，但敏感性较差，通常要比较严重的肝损伤后才会出现升高，因此，胆红素明显升高并出现黄疸是肝损伤严重的提示。R值用于区分DILI的损伤类型。凝血酶原时间是判断肝功能受损的有效指标，INR异常通常是晚期肝功能障碍的表现，往往提示预后不良。

二、新型的生物学指标

在传统生化指标异常前肝脏发生了什么，我们有没有办法更早地预测潜在的DILI？近年来，随着药物基因组学、蛋白组学、代谢组学和转录组学方面研究不断进步，为寻找新型的生物学标记提供了可能和新的线索。

（一）药物基因组学

遗传和环境因素是决定个体间差异最重要的因素，基因是导致不同个体DILI敏感性不同的原因。研究发现，多种HLA等位基因与不同药物引起的DILI有关。Lucena【7】等人采用全基因关联研究(GWAS)的方法对201例DILI患者HLAⅡ型单核苷酸多态性（SNP）进行研究，发现SNP rs9274407与阿莫新林-克拉胃酸引起的DILI有关。随后，Krawczyk【8】等人采用GWAS的方法证实了HLA-B*5701、 HLA-A*020、 HLA-DQB1*0602分别与氟氯西林、阿莫西林、克拉胃酸引起的DILI有关。尽管研究取得了一定进展，但这些生物标记能否用于临床，还面临着诸多挑战。

（二）蛋白组学研究

Bell【9】和他的同事利用DILIN收集的患者ALT峰值时期的血清样本，首次采用一种无指标广谱蛋白质表达分析方法，分析急性DILI样本和对照组血清蛋白质表达的差异，结果共发现92种差异表达的蛋白质，这些蛋白质涉及到多种细胞功能和途径，包括炎症、脂肪变性、胆汁淤积、免疫反应、细胞坏死和凋亡。载脂蛋白E是其中最有力的指标；Fumurylacetoacetase是唯一一种能够在肝细胞型和胆汁淤积型DILI中区别表达的蛋白质。载脂蛋白E是DILI急性反应期和炎症反应时变化明显的蛋白质，可以说是一种前景较好的生物学标记，但研究中未提及能否区分哪些病变能够进展。药物刺激体外培养肝细胞，对乙酰氨基酚处理的HepG2细胞羧酸酯酶【10】（CES1）活性升高，该酶也可见于对乙酰氨基酚引起严重的肝损伤（AILI）。 胺碘酮处理体外肝细胞醛酮还原酶1C1活性升高，可能与胺碘酮引起肝细胞脂肪变性有关。但体外细胞培养与正常人体肝细胞的生存环境不一致，所以细胞体外培养研究的结果能否转化到临床应用，还需要更多研究证实【11】。对乙酰氨基酚是引起DILI最常见的药物，有研究发现10种与急性肝损伤关系密切的蛋白质， CaM的变化与血清ALT变化相近，发生改变时间早，敏感性高，是较为理想的生物学指标。去年Jürgen Borlak【12】等人又利用蛋白质SDS-PAGE电泳体系和基质辅助激光解吸电离的方法鉴别AILI易感者血清基因水平以外的生物学标记，并对C-反应蛋白，触珠蛋白和血液结合反应素等物质进行了定量免疫学分析。结果显示试验组20种蛋白表现出差异性表达，其中包括纤维蛋白溶酶原等10种蛋白质表达改变与AILI有关。目前人体和动物试验中验证过的酶有很多种，尽管仍存在局限性，但部分已用于临床。包括GSTα、GGT、5-核苷酸、山梨糖醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷胱甘肽脱氢酶和胆盐等。因此，蛋白组学迄今仍未发现兼具敏感性和特异性的DILI生物学标记。

（三）代谢组学研究

代谢组质谱分析【13】是伴随药物安全性监查出现的一种检查手段。Clayton【14】等人在其文章中提出了“药物-代谢组学”的概念。Winnike[15]等人通过药物处理前后尿液代谢物的差异性，认为这种差异可以区分AILI易感者，但只能在肝损伤发生之后。 Kim[161]等人结合主成分分析和偏最小二乘法判别分析的方法，采用核磁共振质谱分析的方法研究人体应用3g/dayAPAP连续处理7天后，血液和尿液生化改变。研究发现血清中除了转氨酶出现明显升高，其他的生化参数虽然也发生变化，但大都在正常范围。而此时尿液中的内源性代谢产物氧化三甲胺、柠檬酸盐、3-酪氨酸、苯基丙氨酸、甘氨酸、马尿酸盐和戊二酸，以及血清中乳酸、葡萄糖、异亮氨酸等多种内源性代谢产物发生明显改变。因此这项研究提示我们血清和尿液中的代谢产物敏感性明显高于常规的生化参数。谷氨酸脱氢酶（GLDH）、嘌呤核苷酸脱氢酶（PNP）、苹果酸脱氢酶(MDH)和对氧磷酶1是体内多种重要代谢途径的关键酶，多数在肝内产生。Schomake【31】及其同伴通过对不同年龄段的800多研究对象进行调查研究上述酶的诊断价值，发现GLDH和MDH在AILI患者体内改变确实与血清ALT变化相关，具有较高预测效力。代谢物变化敏感性高，但容易受多种因素的影响如肝脏原有的病变、饮酒、肝外病变等。因此，在使用时需将所有的混杂因素考虑在内。

（四）转录组学研究

白蛋白、α-微球蛋白、载脂蛋白h以及Gc主要是由肝脏产生，其转录水平的变化具有肝脏特异性，因此有研究指出这些成分可以作为DILI候选生物标记。Shingo Okubo【17】等人用不同的毒性物质处理大鼠，采用RT-PCR的技术检验不同大鼠体内以上四种蛋白的mRNA改变。结果发现四种mRNA都发生了明显变化，不仅与ALT的变化相关联，且明显早于ALT活性改变。以上证据提示肝脏特异性mRNA作为生物标记的可靠性和实用性。MicroRNA【18】是一种非编码的ssRNA，调节基因表达，序列保守，具有理想生物标记的特点：稳定、易得、肝脏特异性高、序列保守。因此很多研究指出microRNA是理想的DILI生物标记，研究中发现多种microRNA发生改变，但是最明显【19】的是miRNA-122和miRNA-192。这两种miRNA在AILI患者体内明显升高，与血清ALT变化一致。而且，引起DILI的药物不同，miRNA种类改变也有所差别，如miRNA192明显升高，miRNA128中度升高仅见于AILI【20】。MiRNA122占肝脏miRNA的70%【21】肝脏特异性高，有研究认为miRNA能够区分肝内和肝外疾病，DILI时，早于ALT发生改变，敏感性高。另外有人认为miRNA能区分肝损伤类型【22-24,30】如肝细胞型、胆汁淤积型、脂肪变性等。MiRNA序列保守【25】决定了它易于向临床试验和实践中转化。但是虽然miRNA作为候选的生物标记具有以上优势，但仍有很多问题需要我们进一步研究解决，如精确性、普适性、经济性等。

（五）其他新型的生物学指标

随着DILI发病机制研究的不断进展，炎症反应、免疫反应以及细胞死亡在DILI发生发展中的作用逐渐的被认知。其中涉及的多种成分也被看作是较为理想的生物标记。细胞因子在炎症和免疫反应中发挥重要作用，亦易获取和定量，是理想生物标记的候选，也得到很多研究【26-29】的证实，但不同个体间细胞因子的基线水平差异较大，即使是严格控制了被研究对象的饮食等各种混杂因素，这种差异仍然存在。实验室研究过程的造模使用的药物剂量远远超出了临床用量，导致模型出现明显细胞因子改变，但临床可能并非如此。鉴于我们对炎症反应在DILI的发生进展以及预后之间的关系还不清楚，所以细胞因子能否用于预测和判断DILI预后尚需更多的研究。角蛋白18（KC18）是近期刚发现的一种新型的生物标记，是一种中间丝蛋白，肝内含量丰富，肝细胞死亡后释放的胞外。分为完整型（M65）和裂解型(M30)两种。Petra Thulin【32】的研究发现AILI患者血清样本中miRNA122和M65变化与ALT活性改变相关，且早期即出现明显的改变，无论在敏感性还是特异性上都远远的超[33]过了传统的ALT。M65半衰期较短，有助于预后和临床处理的疗效判断。最近也有研究指出miRNA122和M65变化能准确的判断患者是否需要NAC解毒。

结论

探寻新的生物标记不仅有助于DILI的临床诊断和治疗，而且有利于对DILI发病机制进行深入的研究。但这些生物标记在应用于临床前仍有很多问题需解决。目前已初步探索的潜在有效的生物标记还需在更广范围人群中进行验证。

通信作者：茅益民，Email: maoym11968@163.com 基金项目：“十二五”科技重大专项（2012ZX09303-001，2012ZX09401004）

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